01研究背景

酱油是全球消费最广泛的发酵调味品之一，以其独特的鲜味和香气而闻名。酱油通过大豆和小麦的微生物发酵生产，原料经过蛋白水解、碳水化合物降解和美拉德反应，产生多种多样的风味活性化合物。苦味虽然通常被认为是一种不受欢迎的味道，但在平衡整体风味方面起着关键作用。然而，酱油中过重的苦味会影响消费者的接受度，因此研究苦味的来源和调控对于提高产品质量至关重要。酱油中的苦味主要来源于蛋白质降解过程中产生的苦味肽和游离氨基酸。其他化合物和相互作用也会影响这一感官属性，包括美拉德反应产物、酚类化合物、有机酸和矿物离子，它们可能直接产生苦味或协同增强苦味感知。苦味游离氨基酸是酱油苦味的主要来源，多种苦味游离氨基酸如亮氨酸已被证明是酱油中的滋味活性物质。对酱油中苦味肽的研究逐渐成为热点，但目前尚无关于含量超过阈值的滋味活性肽的报道。酱油中苦味肽的含量通常在nM水平，而阈值一般在µM水平。因此，酱油中的大量苦味肽可能与其他苦味物质在不超过阈值的水平上产生协同增苦效应。

在发酵过程中，大豆和小麦中的蛋白质被蛋白水解酶水解形成肽和氨基酸。其中一些肽和氨基酸具有疏水特性，并导致酱油产生苦味。它们可以与人类苦味受体相互作用，触发苦味感知。新兴研究已鉴定出发酵食品（包括酱油）中的滋味活性肽，并对其感官特性和功能应用产生了越来越大的兴趣。苦味肽通常由3-15个氨基酸残基组成，由于其结构特征（包括序列组成和氨基酸残基的性质）而呈现苦味。超高效液相色谱-串联质谱法能够鉴定苦味肽，而感官引导的分馏法可以分离滋味活性化合物。此外，分子对接和定量构效关系模型进一步将肽序列与苦味强度关联起来，为有效筛选滋味活性肽提供了预测工具。通常，肽的苦味与其疏水性和空间构象相关。疏水性氨基酸，如亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和脯氨酸，是苦味的关键决定因素。在酱油中鉴定出的三肽LLP也显示出苦味和高疏水性。

苦味受体是G蛋白偶联受体家族的一员。它们不仅在味蕾细胞上表达以感知苦味，使生物体能够识别和避免有毒物质，还在呼吸系统和内分泌系统中表达，在多种基本生理过程中发挥关键作用。然而，迄今为止，苦味肽与受体的关键结合位点和亲和力尚未完全阐明。有必要开发基于配体-受体相互作用的新的验证方法，以补充感官评价和分子对接方法。

在本研究中，通过从酱油中富集苦味成分后，使用LC-MS/MS进行肽的鉴定。结合Q值计算和在线预测工具筛选潜在的苦味肽。然后通过合成肽的感官评价获得其味觉属性和阈值。利用HEK-293T细胞系建立了苦味受体异源表达和cAMP信号抑制反应的快速分子筛选技术。研究了苦味肽与TAS2R4之间的相互作用，并探究了苦味肽的信号转导机制。此外，通过分子对接表征了cAMP阳性苦味肽与苦味受体的相互作用，这有助于揭示关键结合位点和结合力。

02研究结论

通过整合肽组学、感官评价、细胞生物学和分子对接的综合方法，研究了酱油苦味的分子基础。采用乙醇提取苦味肽，并通过液相色谱-串联质谱法进行鉴定。基于毒性、致敏性、苦味预测和疏水性计算，筛选出17种苦味肽候选物。感官评价显示，其中13种肽呈现苦味，8种肽能显著增强酱油中6种关键游离氨基酸的苦味。利用基于HEK-293T细胞的cAMP测定法，鉴定出FYL和VLY是hTAS2R4受体的配体（EC50值分别为62.11 µM 和 199.51 µM）。分子对接揭示，这两种肽主要通过疏水相互作用与VAL85、PHE88和PHE62等残基结合。这些发现为酱油的苦味形成机制和风味改良提供了理论依据。

03创新点

首次整合肽组学、感官评价、细胞生物学与分子对接技术，系统解析了酱油中苦味肽的分子基础；从酱油中筛选并鉴定了13种新型苦味肽，其中8种首次被证实可显著增强关键苦味游离氨基酸的苦味强度；首次利用基于cAMP信号抑制的细胞功能实验，证实了FYL和VLY两种苦味肽是人苦味受体hTAS2R4的有效配体（EC50分别为62.11和199.51 μM），而此前研究多采用钙信号途径；通过分子对接揭示了疏水相互作用（如Pi-Alkyl、Alkyl、Pi-Pi Stacked）和氢键是苦味肽与受体结合的主要作用力，并明确了VAL85、PHE88、PHE62等关键结合位点，为理解酱油苦味形成的受体机制及风味调控提供了新的理论依据。

04图文赏析

来源：公众号-食品生物技术与大健康

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/xd6ER8aw6q47NaZ4vkWHrw