双孢菇滋味鲜美，呈味物质丰富，可以赋予烹饪菜着丰富的口感，被广泛应用于炒菜、炖汤、酱料以及其它调味品中。Kokumi肽作为一种新型活性肽类物质，具有良好的味觉特性，少量添加便能增强复合溶液或肉汤的基本味觉，在与其他呈味物质相配合时可以引起味觉品尝方面的醇厚感、冲击感、满口感、绵延感、及增强甜咸鲜味感的复杂性。

本研究将超滤得到分子量在3000 Da以下的双孢菇提取物，应用于鸡汤、骨汤及鱼汤中，定量分析双孢菇提取物对三种肉汤的减盐效果，为提高汤类产品的品质提供参考。

01材料与方法

01材料与试剂
新鲜双孢菇上海联中食用菌合作社;老母鸡、活鲫鱼、猪筒骨、生姜沃天百联生活超市;麦芽糊精、谷胱甘肽、硫酸奎宁上海泰坦科技股份有限公司;谷氨酸钠、无水柠檬酸、蔗糖食品级，河南万邦实业有限公司;氯化钠联合利华;甲醇、乙腈色谱纯，美国TEDIA公司;甲酸美国Thermo公司;氨基酸标准品，Sigma公司;合成肽(EYPPLGR、EWVPVTK)购于南京肽谷生物科技有限公司。

02双孢菇提取物协助减盐前后描述性感官分析
根据(IS0,8586-2012)成立感官评价小组，参考GB12313-1990及Ueda等的感官评定方法进行改进和完善，感官品评小组设置12名成员(20~28岁，男女各半)并进行培训。采用0.08%柠檬酸、1%蔗糖、0.01%硫酸奎宁、0.4%氯化钠、0.35%谷氨酸钠的水溶液分别作为酸、甜、苦、咸、鲜味的标准品及采用0.1%谷胱甘肽的鸡汤溶液作为训练各成员的浓厚感。其他滋味属性评价参考西村敏英等《食品科学和生理学中的Koku味--适口性重要概念的研究进展》一书，对上述不同种类样品的滋味属性进行描述性感官评价，感官评分采用5分标度法，0分为该味觉无法被感知，5分为该味觉特性极强，所有感官评价试验均在上海应用技术大学感官评价室中进行。

03双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中咸味强度评价
利用时间强度感官评价法(Timeintensity,Tl)来研究样品中咸味强度随时间的动态变化。根据《感官属性要求时间强度评估标准指南》对12名感官评价员进行培训，评价员熟悉时间强度感官评价法的整个过程，并对咸味强度的判断进行训练。从评价员饮入15mL汤时开始计时，每隔2s收集一次咸味强度数据。在饮入后30s后结束计时。在此过程中要求评价员对三种肉汤的咸味强度进行评价。

04双孢菇提取物中Kokumi目标肽的感官评价
采用超滤(UF)、凝胶过滤色谱(GFC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化双孢菇中的呈味肽。利用反向液相色谱分离得到的呈味最强的组分采用液相色谱质谱联用仪(RPLC-MS/MS)进行分离鉴定。鉴定得到肽序列为EYPPLGR(830.4286 Da)、EWVPVTK(857.4647 Da)的两条目标肽。利用固相合成法合成整个肽序列，进一步通过感官实验来验证合成肽的呈味特点。将0.1%的目标肽EYPPLGR、EWVPVTK添加到1.2.2的空白鸡汤溶液中。将配制好的鸡汤溶液送至感官小组成员进行描述性感官评价。感官评价方法按照1.2.3.2。

02结果与分析

01双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中滋味属性描述性定量感官评价分析
双孢菇提取物协助减盐的三种肉汤中未感知到苦味，其他滋味属性描述如图1所示。由图1可知，利用双孢菇提取物协助减盐后,三种肉汤中的咸味、鲜味及厚味强度增长明显。咸味强度在鸡汤中增长量最高，增长了1.5倍;鲜味及厚味在鱼汤中增长了最高，分别增长了1.4倍和1.7倍。双孢菇提取物协助减盐前后在肉汤中咸味、鲜味无显著性差异(P>0.05)。其他滋味也有不同的增强效果，三种肉汤的复杂感增强，减盐效果明显。但其加入会给较为清淡的骨汤带来异味，削弱骨汤本身的味道，肉味、骨髓味减弱，且呈味氨基酸与核苷酸的总体含量低于鸡汤和鱼汤，骨汤中的离子强度高，缓冲效应强，也会导致鲜味咸味增加不明显应用效果不佳。双孢菇提取物在鸡汤和鱼汤中应用效果佳，在鱼汤中不仅减盐增鲜还使其整体风味增强，鱼汤更加香甜。

02TI法评价双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中咸味强度
通过多次试验，根据试验重现性，结果如图2所示，在饮入后30s后，双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中的咸味强度都呈现先上升后下降的趋势。前4s，减盐前在三种肉汤中的咸味强度要强于减盐后，减盐前后的咸味强度曲线交叉后、减盐后的咸味强度始终高于减盐前;在整体上，双孢菇提取物协助减盐后在三种肉汤中的咸味强度降低速度较慢，而减盐前三种肉汤的咸味强度降低速度较快。咸味在口腔中持续的时间长于减盐前，是因为双孢菇提取物含有Kokumi肽，在与其他呈味物质相配合可以引起味觉品尝方面的绵延感、增强咸鲜味感的复杂性，缓释、延迟了咸味感知使味感更加持久。

03目标肽的感官评价
将0.1%的目标肽EYPPLGR、EWVPVTK分别添加到空白鸡汤中，两种肽在鸡汤体系中均表现出浓厚感、满口感、绵延感和增强味觉复杂口感的风味特征。如图4所示，两种肽在鸡汤中增强咸味、鲜味及厚味效果明显，甜味感知也有所增强。除此之外，两种目标肽在鸡汤中都表现出酸味增强的特点，这可能是由于在合成肽的过程中醋酸盐的残留所造成的，或是目标肽本身具有酸味的特点。通过感官验证，双孢菇提取物中分离纯化鉴定出的两条Kokumi目标肽在鸡汤中起到了减盐作用。

03结论

本研究发现双孢菇提取物对三种肉汤均起到减盐作用。试验结果表明，双孢菇提取物的添加使得肉汤中游离氨基酸的含量均有所增加，减盐后游离氨基酸含量显著高于减盐前;5’-核苷酸对鸡汤和骨汤的呈味贡献影响较小;感官评价确定双孢菇提取物的添加对肉汤起到增咸作用，并且会延长咸味在口腔中的持续时间，总体风味强度也有所增强。双孢菇提取物添加到肉汤里不是仅增加呈味核苷酸和氨基酸的含量，其中双孢菇提取物中含有的Kokumi肽也起到增鲜增咸的效果。试验验证了双孢菇提取物在三种肉汤中协助减盐作用明显，在鱼汤中应用效果最佳，直接减盐33%。双孢菇提取物不仅起到减盐提鲜的效果还能增加汤的持久性、丰富性。