摘 要

   为改善低等级中国黑松露的风味特征，本研究开发了一种结合水提取与发酵的方法。通过感官评价、挥发性与非挥发性代谢组学分析，追踪了发酵过程中香气、挥发性有机化合物（VOCs）及非挥发性代谢物的动态变化。发酵过程使感官特征由原本的泥土味和皮革味转变为更宜人的奶油香、果香以及发酵相关的风味。

   在实验条件下，第6天达到最佳发酵阶段，此时挥发性物质含量也达到峰值。气味活度值（OAV）分析鉴定出24种关键香气成分，主要为醇类和酯类，包括苯乙醇。KEGG通路富集分析表明，风味形成主要依赖于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成以及三羧酸循环（TCA循环）。这些发现阐明了发酵松露产品中香气形成潜在的代谢基础，为高价值调味品的开发提供了理论依据。

引 言

   黑松露（Tuber indicum）是一种享誉全球的食材，以其野生、复杂而优雅的风味以及丰富的营养价值著称。研究表明，其含有大量脂肪、果胶、食物能量、总酚类和黄酮类物质，具有显著的抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤作用。然而，低等级的中国黑松露香气复杂度较低，市场价值也相对较低。在食品工业中，通常采用适当的技术将低等级原料加工成高附加值产品。

   目前，食品加工方法已得到广泛研究。以食用菌为例，干燥、冷冻、腌制、罐装和发酵等技术被证实是有效保留风味和营养成分的方法。其中，发酵常被提及，因其在营养和膳食价值方面具有稳定的质量、高效率以及显著的产量，有助于发挥其治疗和促进健康的作用。Sivamaruthi 等人综述了发酵蘑菇的营养成分、微生物动态及其对健康的影响，结果表明发酵可引起食用菌中多种生化变化，从而影响其营养、风味和质地。迄今为止，关于松露发酵工艺的研究已广泛开展。Cheng 等人研究了培养基和工艺对白松露固态发酵产品香气的影响，结果表明，四周的固态发酵能更好地保留香气。Vahdatzadeh 等人探讨了菌株选育是否能够改善松露菌丝的风味。研究结果表明，不同菌株之间的香气差异主要与通过Ehrlich途径的氨基酸分解代谢有关，而相关代谢产物所形成的风味对香气特征具有显著影响，感官分析也证实了这一点。

   根据文献调研发现，目前用于松露加工的发酵方法主要包括固态发酵和液态发酵，研究重点集中于松露发酵产品的抗氧化性、生物安全性、风味及药用价值，其中部分发酵过程中的代谢途径被认为对松露特有香气的形成至关重要。然而，关于利用外源微生物作为发酵媒介处理松露水提取物的研究却鲜有报道。该技术已在乳制品、葡萄酒、水果及其他食品饮料领域广泛应用，研究结果表明，此方法适用于生产高附加值、感官品质优良且营养丰富的功能性产品，如调味饮料等。健康食品和优质调味品。

   在多种用于增强风味的酵母中，非酿酒酵母因其能通过胞外酶释放香气前体物质，并生成酯类、高级醇及其他挥发性化合物，从而提升感官品质而受到越来越多关注。毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种成熟的工业酵母，具有强大的氨基酸代谢能力、酯类合成能力和胞外酶活性，可高效将复杂底物转化为具有香气活性的代谢产物。这些特性使其成为黑松露水提取物发酵的理想候选菌株，因为该提取物富含氨基酸、碳水化合物以及潜在的香气前体物质。然而，其在黑松露水提取物发酵中的应用及其香气演化相关的代谢机制仍鲜有研究。因此，本研究计划利用一种常用的外源微生物菌株——毕赤酵母（Pichia pastoris），开发一种新型的液体发酵法来制备黑松露（Tuber indicum）水提取物。

   微生物发酵是一种生物活动形式，其速率、品质和安全性受到多种因素的影响，例如摇床转速、发酵温度、菌种接种量以及发酵时间等。在这些因素中，发酵时间被认为是影响发酵程度的关键因素，最终决定了发酵产品的品质与性能。Wang 等人研究了发酵时间对云南工夫红茶品质的影响，发现中等时长（3小时）为最佳发酵时间。因此，本研究旨在比较不同发酵阶段的香气演变。

   感官品质是食品中最引人关注且重要的因素之一，它决定了食品的特征、情感体验和食欲，最终影响消费者的接受度。而感官品质的背后，挥发性有机化合物（VOCs）被认为是主要贡献者。如今，挥发性有机化合物（VOCs）检测所采用的表征方法已取得显著进展。例如，顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）因其省时、省力且高效的特点，被视为VOCs表征的“金标准”。随着人们对感官品质及风味背后VOCs的关注日益增加，食品发酵领域的科学家和工程师也开始关注非挥发性代谢物，特别是那些能够反映VOCs潜在生成途径的关键差异性非挥发性代谢物。通常认为，微生物活动通过糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢及其副反应，使非挥发性物质转化为小分子挥发性成分，从而产生多种香气物质。因此，采用合适的方法追踪发酵过程中非挥发性代谢物的变化，是揭示黑松露发酵产品（TFPs）风味形成代谢基础的关键。

   基于超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS）的非靶向非挥发性代谢组学，已被报道在高灵敏度、高分辨率和高通量条件下，能够全面、无偏倚地分析多种代谢物，广泛应用于生物医学、食品科学及发酵研究中的生物标志物发现和代谢通路分析。Tan 等人采用非靶向代谢组学方法研究了红茶在发酵加工过程中非挥发性化学成分的动态变化，结果表明发酵期间非挥发性代谢物发生了显著变化。本研究采用UHPLC-MS为基础的非靶向代谢组学方法，对非挥发性代谢物的变化进行表征，以揭示发酵过程中风味形成潜在的代谢基础。

主要内容

   首次研究了利用毕赤酵母辅助发酵法提取黑松露水溶性成分的方法。通过感官评价、HS-SPME-GC–MS和UHPLC-MS代谢组学技术，揭示了挥发性有机物（VOCs）和非挥发性代谢物的动态变化。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计方法进行降维处理，识别出关键差异代谢物及其代谢通路，为后续工业工艺优化提供了理论依据。