导读

灰枣作为一种药食同源的果实，其产业近年来取得了显著进展。然而，关于其在贮藏过程中品质变化的系统性时间线研究尚属空白。本研究采用仿生感官分析与多组学技术相结合的整合策略，系统探究了灰枣长期贮藏过程中的品质演变规律。视觉商品性因褐变在贮藏两年后开始下降，而嗅觉与味觉品质的峰值变化分别发生于贮藏一年和三年后。尽管仿生传感揭示了多维品质演变模式，但整合组学分析在GC-IMS和LC-MS/MS共同支持下，确定一年期为关键转变阶段。非挥发性代谢物分析显示，281种代谢物在贮藏第一年内发生显著变化。大多数代谢物丰度变化有限，仅86种代谢物呈现大幅波动，其中包括枣类典型功能成分cAMP与cGMP。此外，本研究初步筛选出兼具贮藏溯源潜力与营养/安全风险评估价值的候选代谢物标记。本研究结果为品质追踪、货架期评估及生物标志物发掘提供了重要理论依据。 

亮点

1、本研究通过感官评价与代谢组学分析，揭示了‘灰枣’品质变化的特征峰值。

2、在贮藏第一年内，非挥发性与挥发性化合物均发生组分重构。

3、32.4%的代谢物发生显著变化，其中仅86种组分呈现剧烈改变。

4、 长期贮藏过程中特征性成分发生系统性转变。

实验设计

结果

1.     长期贮藏过程中外观属性的变化

灰枣的感官特征是表征其长期贮藏后品质变化的直接指标。首先，果实尺寸是消费者评价灰枣的首要标准。在中国，干制灰枣在进入商业流通前通常需进行分级处理。本实验所用原料依据《新疆主导灰枣标准》被划分为"特级"，其尺寸略高于标准参数：纵径30.61±1.4 mm，横径22.49±1.3 mm，单果重6.95±0.9 g。经过三年贮藏后，未观察到显著的尺寸缩减，这主要归因于密封条件下水分保持稳定（20.4%–24.1%）（图1C）。

图1. 干制灰枣长期贮藏期间的表型变化，包含果皮(A)与果肉(B)色差统计分析结果；(C) 灰枣果实长期贮藏过程中营养成分与水分含量的变化趋势。

但色差分析与视觉评估显示，果皮颜色由鲜红色逐渐加深至暗沉色调（图1A），该结果与Pan等的研究一致。初始色度值（S0阶段）为L⁎=32.75, a⁎=4.01, b⁎=16.09, C⁎ =29.17, H°=33.49；随着贮藏时间延长，L⁎、a⁎、b⁎和C⁎值均呈现逐年递减趋势。果肉颜色从米白色（L⁎=68.15, a⁎=9.35, b⁎=35.06, C⁎=36.30, H°=75.10）逐渐褐变，且褐变从果实顶端开始并向果柄方向蔓延。该过程伴随a⁎值逐年显著上升与H°值下降，而b⁎与C⁎值未呈现一致变化规律（图1B）。果皮在脱水后初期保持光滑质地，仅出现轻微皱缩；至S3阶段则观察到明显表皮剥落现象。这些理化变化共同导致商品性下降（尤其在贮藏2年后），证明色度参数相较于尺寸稳定性更能作为关键品质指标。

2.     长期贮藏中嗅觉-味觉特性变化

2.1 基于电子鼻与GC-IMS的嗅觉体验演变

在嗅觉体验方面，‘灰枣’样品呈现出典型的灰枣特征香气，开启密封包装时尤为明显。电子鼻分析显示金属氧化物传感器W5S、W1S、W2W和W2S均产生强烈响应（图2A），其中W5S与W1S的变化最为显著（附图1B）。具体而言，W5S响应强度在贮藏1年后下降40.1%，而W1S响应则呈现持续逐年上升趋势，至第三年时增长达1.25倍。相比之下，W2W与W2S的波动相对较小。多元统计分析表明，在比较连续年度变化时，主成分第一维度的最大差异出现在S0与S1阶段之间（图2A，附图1A）。

图2. (A) 基于电子鼻的‘灰枣’长期贮藏期挥发性物质雷达图与线性判别分析；(B-D) 不同贮藏期‘灰枣’果实挥发性化合物的GC-IMS图谱与主成分分析：(B) 三维谱图，(C) 偏最小二乘判别分析图，(D) 指纹图谱。

为精确表征长期贮藏过程中的香气演变，研究者采用GC-IMS技术（附图2A、B）对挥发性化合物进行解析，共鉴定出31种代谢物，主要归类为醛类、酯类、酮类、醇类和萜烯类（图2D）。最显著的丰度波动（包括上调和下调）均出现在S0至S1阶段。另一组数量较多的代谢物则延迟至S3阶段才出现上调。相比之下，S1与S2阶段间的代谢物变化极小。GC-IMS数据的PLS-DA分析验证了电子鼻结果，证实连续贮藏年度比较中S0与S1样本间差异最大（图2C）。此外，该分析还检测到第三贮藏年的显著变化。

通过关联分析电子鼻传感器响应与GC-IMS检测的挥发性化合物丰度变化，研究者初步揭示了引起‘灰枣’干果嗅觉变化的挥发性代谢物组成。长期贮藏过程中，灰枣的复杂香气轮廓发生特异性改变，伴随特征香气的减弱，该现象与电子鼻中W5S传感器（宽谱检测）的检测结果一致。相关性分析结果（附图3）显示，在S0至S1阶段丰度显著降低的17种代谢物中（图2D红色虚线框），有13种表现出相关系数≥0.9（p值<0.05），包括1-羟基-2-丙酮、1-己醛（单体）、2,2,4,6,6-五甲基庚烷（三聚体）、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-己烯醛（二聚体）、2-己烯醛（单体）、4-甲基噻唑（二聚体）、4-甲基噻唑（单体）、乙酸（二聚体）及环戊酮（二聚体）。这些代谢物是导致嗅觉感知减弱的关键潜在因子。此外，研究者还识别出随贮藏时间延长而增加的挥发性代谢物，其变化趋势与W1S（对甲基类敏感）、W2S（对醇类、醛类和酮类敏感）及W2W（对芳香化合物响应）的检测响应相符。这些代谢物集中分布于指纹图谱的紫色框选区域及非框选区域，可能是引起贮藏期间嗅觉特征发生细微变化的重要因素。

2.2 基于电子舌的味觉体验演变

在味觉评价中，电子舌将鲜味、甜味、苦味、涩味和丰富度识别为‘灰枣’的特征指标，其中鲜味、甜味与苦味最为突出，而酸味则低于检测阈值（图3A）。贮藏期间，鲜味、甜味、苦味、涩味及丰富度的风味强度均呈下降趋势，而酸味虽传感器响应呈上升态势，但仍低于感知阈值。在排除非风味活性参数后，PLS-DA分析表明第一主成分可有效区分样品，其味觉属性贡献度依次为：鲜味 > 苦味 > 甜味。与电子鼻结果不同，PLS-DA分析（图3B）显示S0、S1和S2阶段样品变化相对有限且聚类紧密，随后在S3阶段出现显著的味觉转变（表现为离散分布）。值得注意的是，电子舌检测到五种味觉模态仅出现轻微减弱，而酸味虽显著增加但仍处于阈值以下。这些有限的味觉变化与实际感官评价相符，为超过1年的货架期标识及商业囤积行为提供了生化层面的理论依据。

图3. 基于电子舌的‘灰枣’果实长期贮藏期间雷达图（A）与偏最小二乘判别分析图（B）；（C）基于果实成分含量的‘灰枣’长期贮藏期偏最小二乘判别分析图。

2.3 内在成分含量变化分析

内在成分分析在一定程度上佐证了上述发现。定量结果显示（图1C），‘灰枣’富含多种关键营养成分：总糖（55.12%）、可滴定酸（6.08%）、总氨基酸（25.13 μg/kg）、环磷酸腺苷（56.06 μg/g）与环磷酸鸟苷（29.21 μg/g）。此外，果实表现出显著的生物活性潜力，其中总酚（3.01 mg/g）和黄酮（2.40 mg/g）在次级代谢产物中占主导地位。这些化合物共同构成了干制灰枣区别于鲜食风味的独特品质特征，同时凸显其药食同源特性。长期贮藏过程中，S1与S3阶段显著升高的可滴定酸度（p < 0.05）与电子舌CA0传感器响应值相关，而鲜味与苦味的减弱可能分别对应氨基酸和黄酮类物质的下降。具有抗癌、抗炎及心血管保护功效的特征性营养成分cAMP与cGMP在贮藏期间显著耗竭，其中cGMP在首年即暴跌超75%。值得关注的是，基于成分数据的PLS-DA分析（图3C）呈现与电子鼻结果相异的趋势，S0阶段与贮藏样品（S1-S3）分离度最大。为排除检测偏差，本研究进一步采用非靶向代谢组学技术，以全面解析非挥发性代谢物动态与通路水平变化。

3.     长期贮藏中非挥发性代谢物变化分析

为全面探究非挥发性代谢物动态，研究者通过LC-MS/MS进行非靶向代谢组学分析。正负离子模式下的质控样本总离子流图显示色谱峰分离良好、强度分布均一，验证了系统稳定性与数据重现性（附图4）。研究者共检测到6861个代谢特征，初步鉴定并注释1019种化合物（正离子模式550种，负离子模式469种）。已鉴定代谢物涵盖两大类别：植物次级代谢产物与生物活性物质。前者主要包括生物碱、苯丙烷类、黄酮类、萜类、聚酮类、氨基酸衍生物、脂肪酸衍生物及莽草酸/乙酸-丙二酸途径产物；后者包括碳水化合物、脂质、核酸、有机酸、肽类、甾体、激素与维生素。为提高非靶向检测结果可靠性，研究者通过PCMD、HMDB、PMhub、RefmetaDB等数据库及相关文献，进一步分析了注释代谢物（特别是差异表达代谢物）的潜在植物来源，并排除了代谢物数据库中注释不相关的组分。

多元统计分析结果与基于成分数据的PLS-DA分析基本吻合。代谢组数据的层次聚类（图4A）显示明显分离：S0样本自成独立簇，而贮藏样本（S1-S3）聚集为另一分支。在贮藏组内，S1与S2、S3分离，表明首年后发生新一轮代谢转变。PCA（含质控样本）（图4A）与PLS-DA（图4B）验证了该模式，PC1（方差贡献率分别为76.0%和80.9%）显著区分S0与贮藏样本。沿PC1方向，S2与S3的接近度高于S1与S2。内源性成分分析与非靶向代谢组学多元统计分析结果，与电子舌评估存在显著差异，这进一步证实：‘灰枣’干果长期贮藏后，尽管味觉感知变化微弱，但其内源性代谢谱已发生细微改变，此类改变可能引发营养品质与安全特性的变化，如环核苷酸类成分的显著波动（图1C）。

图4.‘灰枣’果实长期贮藏的多元分析，包括聚类分离（A，左）、相关性网络（A）、主成分分析（A，图标）以及偏最小二乘判别分析（B和C）。

通过对四组样本进行PLS-DA两两比较，研究者筛选出差异表达代谢物，并进一步通过t检验（p < 0.05）与OPLS-DA（VIP >1）进行严格筛选。统计分析表明，长期贮藏过程中相当比例的代谢物发生显著丰度扰动：至S3阶段，发生丰度变化的代谢物占检测总量的32.4%。最显著的差异表达代谢物出现在S0与S1阶段，共281种代谢物呈现显著丰度变化，其中经KEGG注释包含44种植物次级代谢产物与28种生物活性化合物。火山图可视化显示（图5），S0–S1阶段具有更多丰度扰动幅度更大、统计置信度更高的差异表达代谢物，而S1–S2与S2–S3阶段的差异表达代谢物则逐步向坐标轴原点收敛。值得注意的是，S0–S1阶段也是相对于S0保持稳定丰度变化的代谢物数量最多的时期，分别有24种和30种代谢物在后续贮藏期间持续表现为稳定上调和下调。此类代谢物数量在后期贮藏阶段急剧减少（图6）。植物次级代谢产物在上调物种中富集，尤其是苯丙烷类、生物碱和萜类化合物，而生物活性化合物则在上调的碳水化合物中富集。相反，肽类（主要由多种氨基酸组成）、核酸、黄酮类和萜类化合物则呈现较多下调组分。此外，长期贮藏过程中，苯丙烷类、生物碱和萜类化合物同时存在大量上调和下调组分，暗示潜在的代谢物转化过程。尽管味觉感知趋势与代谢物动态存在差异，研究者仍通过差异表达代谢物表达量与感官味觉数据的相关性分析，试图鉴定味觉贡献代谢物。然而，未能发现同时满足高相关系数、强置信度且在数据库中明确注释为苦味、甜味或鲜味的代谢物。

图5. LC-MS/MS分析中两两组间差异代谢物火山图：颜色映射的表达梯度（红色：上调；蓝色：下调；灰色：无显著性）按倍数变化层级分层（浅色：1.0 ≤ FC < 1.5；深色：FC ≥ 1.5），筛选条件为p < 0.05且VIP > 1.0。（注：垂直虚线分别对应x轴数值-1.5、-1.3、1.3和1.5）。

图6. 差异表达代谢物（DEMs）分类统计图：植物次级代谢产物（左），生物活性化合物（右）。

尽管代谢物在长期贮藏过程中呈现广泛的差异表达（以标准化丰度高低比值FC ≥1.0且p < 0.05为基准），但以S0组代谢物表达水平为基线时，经过三年贮藏后仅有86种代谢物（55种上调和31种下调；图7A、C）表现出显著变化（FC ≥1.3；p < 0.05），这体现了中等规模的代谢重塑，占检测代谢物总量的9.0%。为探究代谢物动态与贮藏时间的潜在关联，研究者针对这86种代谢物的时序丰度变化与贮藏时间进行了相关性分析（附表4）。通过优先筛选强相关性代谢物（|r| > 0.95, p < 0.01），最终鉴定出5种候选标志物：2-羟基桉叶素、异紫堇碱、5-二羟基庚-6-烯酸、色氨酸及4-（谷氨酰氨基）丁酸酯。然而，这些标志物作为‘灰枣’干果贮藏时间指示物的实际应用价值仍需进一步验证。

图7. (A) 各贮藏阶段差异表达代谢物（DEMs，FC ≥1.5）表达热图；(B) 差异表达代谢物（FC ≥1.5）的分类统计与定量谱分析；(C) 阶段特异性差异表达代谢物数量（FC ≥1.5）：S1-S3阶段与基线S0的比较分析。

为识别贮藏期间相较于S0阶段具有显著丰度变化的特征代谢物，研究者将FC阈值进一步提高至≥1.5。通过此严格标准筛选出43种代谢物（30种上调和13种下调，图7A、C），这些代谢物均呈现显著变化（FC ≥1.5；p < 0.05）。HMDB注释将其划分为八大类：有机酸及其衍生物（下调4种，上调7种）、杂环化合物（下调3种，上调6种）、脂质及类脂分子（下调1种，上调6种）、苯环型化合物（下调1种，上调4种）、有机氧化物（下调0种，上调3种）、苯丙素/聚酮化合物（下调0种，上调3种）、核苷、核苷酸及其类似物（下调1种，上调1种）、有机氮化合物（下调2种，上调0种）（图7B）。下调组中的代表性代谢物包括鸟苷、L-组氨酸、L-赖氨酸等。在上调代谢物中，研究者发现多种具有药理活性的化合物。与多种植物物种相似，研究者同时鉴定出角型呋喃香豆素白芷素与线型呋喃香豆素补骨脂素。这两种化合物均表现出抗癌与抗炎等典型生物活性，且其在贮藏期间的丰度呈现显著上升趋势。此外，具有神经保护和抗抑郁特性的犬尿喹啉酸及作为尿酸降低剂的鹅肌肽在贮藏期间也呈现显著增长。然而值得关注的是，橘霉素和1,2-萘醌两种风险相关代谢物在贮藏过程中持续累积。橘霉素可被快速吸收（吸收率超40%）并分布至肝脏、肾脏甚至骨髓等器官。尽管1,2-萘醌是某些药物的前体骨架，但越来越多证据表明其通过多种机制介导遗传毒性、神经源性炎症和细胞毒性。长期贮藏中两者水平的升高可能增加人体暴露于1,2-萘醌和橘霉素的风险，影响枣果食用安全。因此，开展1,2-萘醌与橘霉素的精准定性与定量检测，并建立其与货架期品质的关联研究至关重要，这也是团队下一阶段的工作重点。

为追溯代谢物变化的潜在通路，研究者整合了FC ≥1.0代谢物的KEGG富集结果。分析表明芳香氨基酸的合成与分解代谢通路可能驱动众多代谢物含量变化，其中酪氨酸合成与代谢通路尤为突出（附图9A）。在合成过程中，L-芳香氨酸在S1阶段水平提升2.6倍，这可能源于分支酸和3-脱氢莽草酸的转化。在酪氨酸代谢通路中观察到：（a）L-酪氨酸氧化生成L-多巴，后者进一步氧化为4,5-开环多巴和环多巴。环多巴与葡萄糖结合形成环多巴-5-O-葡萄糖苷，而部分L-多巴可脱羧升高儿茶酚胺生物合成通路中的化合物；（b）L-酪氨酸脱氨生成对香豆酸，进而合成5-O-咖啡酰莽草酸（该产物亦可来源于咖啡酸与莽草酸），并进入呋喃香豆素合成通路，导致白芷素与补骨脂素显著增加。该通路中的玛美辛和4-甲基伞形酮水平也同步上调。尽管上下游代谢物波动显著，L-酪氨酸本身仍保持动态平衡，未呈现显著浓度变化。相比之下，另一种芳香氨基酸色氨酸则显著减少（FC=1.49）。在色氨酸代谢通路中（附图9B），犬尿烯酸在先前鉴定的DEMs中增幅最为显著。此外，在天冬氨酸、β-丙氨酸和精氨酸代谢通路中，鲱精胺、腐胺、亚精胺、L-天冬酰胺和L-组氨酸浓度均出现下降（附图9C），这些下降可能与鹅肌肽水平升高相关。尽管检测到1,4-二羟基-2-萘甲酸和1-羟基-2-萘甲酸的升高，1,2-萘醌的具体来源仍有待阐明。

结论

基于整合的仿生感官与代谢组学分析，本研究系统揭示了‘灰枣’干果在常温密封贮藏过程中品质变化的时序规律。视觉商品性与味觉特征的显著改变分别发生于贮藏两年与三年后，而嗅觉特性与挥发性/非挥发性代谢物组成的早期变化在贮藏第一年即被检测到。值得注意的是，281种非挥发性代谢物在贮藏初期已发生显著丰度波动。尽管多数代谢物在长期贮藏中仅呈现统计学显著的小幅度变化，但仍有86种代谢物发生实质性丰度变异（FC ≥ 1.3且p < 0.05），其中包括枣果典型功能成分cAMP与cGMP。通过筛选最终鉴定出5种候选贮藏时间标志物，以及若干具有显著丰度增长特征的功能性代谢物与安全风险相关代谢物。

本研究通过系统解析长期贮藏中灰枣品质演变动力学，填补了该领域的重要知识空白，为优化贮藏能力评估体系及建立循证货架期标准奠定基础。团队后续将优先研发特征代谢物（特别是安全风险因子与生物活性功能成分）的快速检测方案，构建‘灰枣’全产业链溯源与品质分级系统。该体系旨在规范灰枣行业的市场监管与质量控制标准。此外，明确常温开放贮藏（供应链中另一主流采后处理方式）条件下品质劣变的关键阈值，是亟待系统攻关的另一重要科学问题。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.147168

来源：公众号-代谢组metabolome

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/JFuUFZVujEJiX3_X7mm6gw