为了挖掘本土非酿酒酵母的潜力并开发新型发酵剂以增强猕猴桃酒的香气复杂性，本研究将Zygosaccharomyces rouxii、Pichia kudriaxewii和Meyerozyme gallitermondii 两两组合，然后与酿酒酵母进行顺序发酵。全面分析了不同发酵剂对猕猴桃酒化学成分和风味特征的影响，并通过检测关键挥发性物质的变化及其损失率，研究了酒精发酵过程中香气的演变。与单独使用酿酒酵母相比，混合发酵剂不仅提高了抗氧化能力，还增加了酯类和醇类的产量，呈现出浓郁的花香和果香，并具有较高的感官可接受度。结果表明，非酿酒酵母组合与酿酒酵母的顺序接种促进了挥发性物质的形成，同时在酿酒环境中保持了关键香气化合物的稳定性，并降低了酒精发酵过程中的香气损失率。

重点内容

表1展示了四种猕猴桃酒的理化参数。总体而言，不同的发酵处理方案带来了显著差异。

作为菌株生长的主要营养来源，大部分糖在酿酒过程中通过糖酵解途径转化为乙醇和其他代谢产物，所有样品在发酵结束时的残糖浓度均低于4 g/L。有趣的是，最低的残糖含量（3.21 g/L）和最低的酒精浓度（11.05%, v/v）同时出现在Pk-Zr样品中，这可能归因于非酿酒酵母在发酵前期消耗了更多的糖。酸度被视为果酒风味的支柱，适度的酸度为口感带来清新和纯净感。在本测定中，Pk-Mg表现出最高的总酸含量，为18.83 g/L，而Pk-Zr和Mg-Zr与Sc组无显著差异。同时，三种混合发酵方案的pH值显著低于Sc组，这可能是由非酿酒酵母产生的大量酸性代谢物引起的。

颜色被视为感知果酒最直接的方式，决定了消费者的接受或拒绝。所有猕猴桃酒的亮度、红绿度和黄蓝度均与发酵方案密切相关，所有混合发酵方案与Sc组相比，都提高了L*值并降低了a*值。值得注意的是，尽管混合发酵方案在总色差方面与Sc组存在显著差异，但这种差异似乎不足以被肉眼察觉（ΔE* < 2）。猕猴桃酒和原料汁的总酚和维生素C含量如图1a所示。除Pk-Zr外，所有猕猴桃酒中检测到的总酚和维生素C含量均显著高于原料汁。最高的总酚含量和维生素C含量同时在Pk-Mg中测得，分别为857.65 mg GAE/L和863.58 mg/L。唯一的例外是Pk-Zr中的维生素C含量与原料汁相比有所下降，这需要在未来的研究中进一步探讨。

有机酸主要来源于水果本身及发酵过程中的酵母代谢，对猕猴桃酒的风味、色泽和化学稳定性具有重要影响。图1c展示了所有样品中七种有机酸的浓度。从总量来看，Pk-Mg处理显著提高了原料果汁中的有机酸含量，而Sc、Pk-Zr和Mg-Zr则表现出相似程度的下降。奎尼酸和柠檬酸是两种最丰富的有机酸，合计占总量的60%以上，且这两种化合物在发酵前后呈现相反的变化趋势：前者含量的增加可能源于绿原酸在发酵环境中的不稳定性导致其发生水解；后者含量的减少则可能是因为某些菌株能通过细胞膜上的转运蛋白将柠檬酸转入细胞内，将其作为碳源分解。果汁中的草酸和琥珀酸在发酵后显著减少，且四种接种方案间无显著差异。尽管本发酵系统未涉及乳酸菌，仍观察到苹果酸轻微减少和乳酸增加的现象，这可能源于酵母三羧酸循环的中心代谢作用。酒石酸性质稳定，不易受微生物或发酵环境影响，因此被认为是果酒中重要的缓冲物质。部分样品中酒石酸的减少可能是由于其与果酒中的金属离子形成复合物，进而产生沉淀所致。

酚类化合物已被确认为一类重要的生物活性物质，有助于提升猕猴桃酒的滋味、色泽和风味。研究人员对四种猕猴桃酒中的十种单体酚进行了分析，结果如图1d所示。总体而言，四种发酵方案均显著提高了原料汁中的多酚总量，其中混合发酵获得了更高的产量。Pk-Mg组的总浓度最高，达69.98 mg/L，其次是Mg-Zr组（67.29 mg/L）和Pk-Zr组（59.74 mg/L）。与既往研究一致，儿茶素是猕猴桃酒中含量最丰富的单体酚，也是不同样品总含量差异的主要来源。虽然所有方案都显著提高了儿茶素含量，但非酿酒酵母的引入明显效果更佳，这种增长可能源于非酿酒酵母更强的β-葡萄糖苷酶分泌能力所诱导的苷类水解增加。

咖啡酸和没食子酸含量分别位居第二和第三，两者在发酵后均显著增加，且四种方案间无显著差异。数据显示，四种猕猴桃酒中咖啡酸含量范围为10.15-11.12 mg/L，没食子酸含量范围为3.16-3.28 mg/L。先前研究表明，水果中通常以糖苷形式存在的槲皮素具有调节血压、增强免疫力和促进关节健康的巨大潜力。本实验中，槲皮素未在果汁中检出，仅存在于猕猴桃酒中，这可视为发酵对果汁品质的改善。

根皮苷是一种二氢查耳酮类黄酮，具有降血糖和抑制肾脏葡萄糖重吸收的药理作用。在微生物酶的作用下，根皮苷在发酵过程中被大量水解，所有猕猴桃酒中根皮素的浓度均显著增加。绿原酸、肉桂酸和阿魏酸可归类为酚酸，它们结构不稳定且具有活性基团，易受高酒精度和高酸度发酵环境的影响。这三种化合物的浓度在发酵后均显著上升，且增加幅度与发酵方案相关。

香气轮廓被认为是评价果酒质量的重要指标。香气化合物的有无、含量、比例及平衡关系共同构成了产品不同的风格特征。图2展示了猕猴桃酒与原料果汁中挥发性化合物的分布情况。

总体检出与含量

共检测到83种挥发性化合物，包括20种乙酯、10种乙酸酯、19种其他酯类、16种醇类、8种酸类以及10种其他芳香化合物（酮、醛、酚和萜烯），每种化合物至少在一种样品中被检出。从总量来看，所有发酵方案均显著提高了原料汁的挥发性物质含量，且混合发酵剂方案的含量显著高于单独使用酿酒酵母的发酵。其中，Pk-Mg组的挥发性化合物总含量最高，达12,916.47 μg/L；而Pk-Zr组的挥发性化合物种类最为丰富，达60种。

酯类化合物分析

如图所示，酯类是造成猕猴桃酒挥发性物质差异的主要贡献者，三种混合发酵方案因其更丰富的酯类含量而聚集在图的右侧。研究表明，酯类在果酒香气轮廓中扮演着积极角色，被认为是果香和甜味风味的主要来源。

乙酯：主要在醇酰基转移酶催化下，由相应酰基辅酶A和乙醇合成，是猕猴桃酒中含量最丰富的酯类，其含量在发酵期间增加5至9倍。Pk-Mg组的乙酯含量最高，其次是Mg-Zr和Pk-Zr组。辛酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯是浓度最高的三种乙酯，合计占总量一半以上，且其含量均远高于感官阈值，对猕猴桃酒的香气特征贡献显著。

乙酸酯：与乙酯不同，乙酸酯来源于醇-O-乙酰转移酶催化底物的反应。从图中可见，大部分乙酸酯的形成与非酿酒酵母密切相关。异戊醇乙酸酯、2-甲基丁酸乙酸酯、己酸乙酸酯和庚酸乙酸酯是酒中的主要乙酸酯，其中2-甲基丁酸乙酸酯和己酸乙酸酯在发酵过程中产生，可能为猕猴桃酒带来草莓和糖果香气。

其他酯类：尽管其他酯类含量较低，但其对香气复杂性的贡献不容忽视。在涉及Z. rouxii的混合发酵方案中，其他酯类更为丰富，种类也显著多于其他组别。

高级醇类分析

高级醇既是香气物质也是风味物质，在猕猴桃酒中起到衬托酯香、圆润口感的作用。总体而言，所有发酵方案都增加了高级醇的含量，且混合发酵在种类和含量上均显示出明显优势。值得注意的是，具有生青味的1-己醇含量显著降低，而具有花香的苯乙醇和异戊醇含量显著增加，这可视为发酵带来的香气品质提升。

挥发性酸类及其他

果酒中的挥发性酸主要来源于原料和发酵过程。测定共发现8种脂肪酸，其中异丁酸、2-甲基丁酸、1-己酸和1-癸酸仅在猕猴桃酒中检出，而4-氧代庚二酸仅在原料果汁中检出。此外，不可忽视的是，Sc组（单独接种酿酒酵母）的挥发性酸含量和种类均为最高，这可能引入某些不愉快气味。

除上述化合物外，在猕猴桃酒和果汁中还检出三种醛、三种酮、两种酚和两种酯。尽管这些物质浓度相对较低，但由于其感官阈值较低，仍对酒体香气构成有显著影响。乙醛和癸醛在酒中显著增加，而十二醛在发酵过程中损失。较低浓度的乙醛（< 30 mg/L）不仅避免了陈腐风味的产生，还减少了与SO₂的结合，从而改善了酒的抗氧化和抗菌性能，并促进了酒的成熟。具有甜果香的酮类在发酵后也发生剧烈变化，表现为种类减少而浓度增加。除4-乙烯基-2-甲氧基苯酚外，挥发性酚类和萜烯类在猕猴桃酒中均得到显著提升，且混合发酵方案优于Sc组。

如图3所示，主成分分析（PCA）模型的前两个主成分（PCs）共解释了总方差的90.1%，表明该模型足以可靠地解释香气轮廓与发酵方案之间的相关性。主成分一（PC1） 解释了总方差的66.3%，能够清晰地区分混合发酵与单独使用酿酒酵母（Sc）的发酵。具体表现为：混合发酵组（Pk-Mg, Pk-Zr, Mg-Zr）：分布在第二和第三象限，其位置靠近乙酯类和乙酸酯类化合物。Sc组：位于第一和第四象限的交界处，靠近醛类和酸类化合物。主成分二（PC2） 则进一步将三种混合发酵方案明确区分开来。大量香气化合物聚集在第二象限，与Pk-Mg和Pk-Zr两组表现出强烈的正相关性，这些关键香气物质包括癸酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醇乙酸酯、辛酸甲酯和庚酸乙酯等。相比之下，Mg-Zr组位于第三象限，其附近仅有辛酸-3-甲基丁酯、异丁酸乙酯和2,4-二叔丁基苯酚等少数几种化合物。这表明，该样品中的花香和果香特征可能弱于其他混合发酵方案生产的猕猴桃酒。

上述结果证实，非酿酒酵母组合与酿酒酵母的顺序接种方案显著提升了猕猴桃酒的香气复杂性。为了进一步探究香气物质改善的原因并阐明香气轮廓的转变过程，研究监测了果酒发酵过程中关键化合物的动态演变及损失率。

图4展示了27种相对气味活性值大于0.1的挥发性化合物在整个酒精发酵过程中的浓度变化动态。酯类化合物由酵母在酒精发酵过程中通过代谢合成，是关键挥发性物质中占比最高的类别。在四种猕猴桃酒中共鉴定出18种rOAV > 0.1的酯类，它们整体呈现三种不同的演变趋势：在酒精发酵期间持续增加，例如辛酸乙酯、癸酸乙酯和9-癸烯酸乙酯。在发酵早期增加，而在酒精发酵末期持续减少，例如乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酸酯和丁酸甲酯。在发酵早期增加，中期减少，随后在酒精发酵末期再次增加，例如丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯和苯乙醇乙酸酯。值得注意的是，乙酸己酯、乙酸异戊酯、苯甲酸甲酯、辛酸甲酯、2-甲基丁酸乙酸酯和丁酸甲酯的最大浓度均在Sc样品中检测到，且都集中在第5天。这表明酿酒酵母在此时已适应发酵基质并充分增殖。而丙酸乙酯、异丁酸乙酯、癸酸乙酯和9-癸烯酸乙酯则呈现相反的趋势，尤其是丙酸乙酯，仅在涉及非酿酒酵母的方案中检出。

经过感官小组的初步评估和两次讨论，最终确定了猕猴桃酒的主要香气描述词为：花香、热带水果香、柑橘类水果香、黑色水果香、核果香、红色水果香、籽实类水果香、酒味、酸味和植物味。四种猕猴桃酒中各香气描述词的修正频率值及整体可接受度评分如图6a所示。

总体而言，不同的发酵方案赋予了猕猴桃酒不同的香气轮廓，且同一香气特征在不同发酵方案中表现出不同的强度。与Sc组相比，混合发酵方案呈现出更强烈的柑橘类水果香、热带水果香、花香、红色水果香和黑色水果香，同时其籽实类水果香、酒味、酸味和植物味则较弱。这种香气表现很大程度上源于酯类和高级醇的差异。这也验证了先前的研究发现，即接种一种以上的本土非酿酒酵母能有效增强果酒的花香和果香，并进一步提升其独特性和感官品质。

在整体可接受度的聚类分析中，Pk-Mg组获得了最高分4.52分，Mg-Zr组与Pk-Mg组具有较高的相似性，得分为4.29分，其次是Pk-Zr组，得分为4.16分。但无论如何，得益于花香和果香的增强，混合发酵组的整体可接受度评分均显著高于Sc组，这表明使用多酵母发酵在提升猕猴桃酒风味方面具有广阔的应用前景。

为了明确各香气轮廓对猕猴桃酒整体可接受度的影响，研究以各描述词的MF值为自变量，整体可接受度评分为因变量，构建了偏最小二乘回归模型。模型的具体参数见图6b，其校正系数为0.992，验证系数为0.858，显示出良好的可信度。需要指出的是，尽管回归系数仅能从数学上反映描述词与整体可接受度评分之间的相关性，不能直接代表真实的感官接受度，但它们仍能为结果提供一定的指导。柑橘类水果香、热带水果香、花香和黑色水果香的加权回归系数均大于0.1，被认为对整体可接受度评分有积极影响，Pk-Mg和Mg-Zr的高分就与这些花香和果味高度相关。相比之下，核果香、奶酪味、酒味和酸味具有负的加权回归系数，对整体可接受度评分有显著的负面影响。其中，酒味是对总体评分最为不利的因素之一，这有力地解释了为何Sc组的得分较低。

总结

非酿酒酵母组合与酿酒酵母的顺序接种方案有效改善了有机酸和单体酚类物质的组成与浓度，显著提高了猕猴桃酒的抗氧化能力。更重要的是，这些方案也增强了葡萄酒的香气复杂性。与单独使用酿酒酵母发酵相比，采用更复杂的发酵剂组合和接种方案产生了更高水平的酯类和醇类物质，赋予了酒体浓郁的花香和果香，并在感官分析中获得了更高的总体可接受度评分。此外，混合发酵剂对猕猴桃酒的香气演变具有重要影响。香气化合物较低的损失率可能是酒体香气增强的主要原因。

总而言之，通过多种本土非酿酒酵母与酿酒酵母进行顺序接种来优化发酵剂，能够有效促进关键挥发性化合物的演变，并减少酒精发酵过程中的香气损失，从而提升猕猴桃酒的香气多样性与感官品质。建议后续研究进一步探究酵母间的相互作用，并明确导致香气损失的具体原因，为开发更高质量的猕猴桃酒提供有价值的见解。

原文DOI：10.1016/j.foodchem.2024.140758

来源：公众号-食品指南针

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/Qoa0MTTsU8eW2GVk4j3dew