中文摘要：二次微生物发酵在改善黑茶风味方面发挥着关键作用，然而微生物如何调控风味的形成与转化仍不清楚。本研究提出将人工/电子舌感官评价与基于特征的分子网络分析（FBMN）相结合来解决这一问题。感官评价表明，冠突散囊菌发酵通过增加甜味和降低苦味改善了六堡茶的风味，而凝结芽孢杆菌则增强了其陈香风味。FBMN共鉴定出358种化合物，包括10种新型乙基-吡咯烷酮取代黄烷-3-醇B环裂解类似物（eps-FBRFAs）。冠突散囊菌发酵显著增加了FBRFAs、eps-FBRFAs及非酯型儿茶素，同时降低了酯型儿茶素。相关性分析表明，这些上调的代谢物与甜味呈正相关，TAS1R2/TAS1R3可能是FBRFAs和eps-FBRFAs的潜在靶点。凝结芽孢杆菌发酵增加了线性肽，其与陈香风味呈正相关。这些发现加深了对微生物贡献黑茶风味及关键代谢物的理解，为产品品质提升提供了启示。
研究方法：
1.发酵样品制备：以传统六堡茶（Liubao/Liu-Pao tea）为基质，分别接种冠突散囊菌 Eurotium cristatum（8730）、凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans（No. 10059）和 B. coagulans（JZ-1）进行二次微生物发酵，条件为40–60 °C、7 d；以未接种样品（N/A）为对照，并观察干茶与茶汤色泽差异。
2.人工感官评价与电子舌：6名经培训评价员（3男3女，18–55岁）在盲评条件下，对甜、鲜、苦、酸、涩、陈香6个属性进行10分制强度评分，每样品在3个独立日评价，采用单因素方差分析比较差异。电子舌采用SA-402B味觉传感系统，6个传感器检测酸、苦、涩、鲜、咸、甜等9项味觉属性，以人工唾液为参比，每样品5次重复。
3.常规化学成分测定：测定总蛋白（考马斯亮蓝G-250法）、总糖（苯酚-硫酸法）、总多酚（Folin-Ciocalteu法）和总黄酮（氯化铝比色法），用于解释感官变化的物质基础。
4.UHPLC-Q-TOF/MS代谢组分析：茶样依次用80%甲醇、40%甲醇和水超声提取，采用Agilent 6545 Q-TOF与1290 Infinity Binary LC系统、HSS T3柱，以0.1%甲酸水/乙腈为流动相进行33 min梯度分离；MS-DIAL 4.80进行峰检测、去卷积和数据处理。
5.基于特征的分子网络分析（FBMN）：将MS-DIAL输出的MGF和定量CSV文件上传GNPS平台构建FBMN，结合Cytoscape和MolNetEnhancer进行网络可视化与化合物类别注释；依据MS/MS碎片模式和结构相似性预测相邻未知节点结构。
6.差异代谢物与关联分析：基于鉴定化合物峰面积进行PCA和OPLS-DA，以VIP≥1且p<0.05筛选差异代谢物；采用RDA和相关热图分析差异代谢物与感官/味觉属性的关系；用AutoDock Vina和PyMOL将FBRFAs、eps-FBRFAs与人类甜味受体TAS1R2+TAS1R3 VFT结构进行分子对接，评估结合能和氢键。
7.通路推断：结合MS/MS鉴定、差异积累和文献，提出eps-FBRFAs的可能生物合成途径，并以茶氨酸等前体变化进行佐证。
关键结论：
1.菌株依赖性的风味改善：冠突散囊菌发酵显著提高六堡茶甜味和鲜味、降低苦味，形成更明显的醇甜和菌香；凝结芽孢杆菌主要增强陈香，其中No. 10059偏原陈香，JZ-1更醇厚并带奶酪样香气。电子舌结果与人工感官一致，冠突散囊菌组甜味最高、苦味最低，鲜味明显升高。
2.鉴定358种化合物，发现10种潜在新eps-FBRFAs：包括249种黄酮、21种肽、6种氨基酸、32种脂质和50种生物碱/核苷。首次在六堡茶中初步注释10种乙基吡咯烷酮取代黄烷-3-醇B环裂解类似物（eps-FBRFAs），并发现FBRFAs、eps-FBRFAs及含吲哚环二肽等在冠突散囊菌发酵样品中显著富集。
3.冠突散囊菌调控儿茶素与甜味相关代谢物：冠突散囊菌发酵显著增加FBRFAs、eps-FBRFAs和非酯型儿茶素，降低酯型儿茶素；这些上调代谢物与甜味正相关，TAS1R2/TAS1R3可能是FBRFAs和eps-FBRFAs的潜在靶点。分子对接支持其与甜味受体存在结合可能，但直接甜味活性仍需功能验证。
4.凝结芽孢杆菌促进线性肽积累并与陈香相关：凝结芽孢杆菌发酵增加线性肽（如Pro-Glu-Val等），线性肽与陈香风味正相关，提示其通过蛋白水解作用改善陈香。常规成分上，凝结芽孢杆菌发酵降低总蛋白和多酚；冠突散囊菌发酵提高总蛋白、黄酮呈增加趋势，可溶性糖无显著变化。
5.提出eps-FBRFAs可能形成途径：酯型儿茶素转化为非酯型儿茶素后生成FBRFAs；茶氨酸经Strecker降解产生乙基吡咯烷酮，再与FBRFAs的C-8位共轭形成eps-FBRFAs。冠突散囊菌发酵中茶氨酸显著下降，支持该途径假设，但具体反应仍需验证。
6.总体意义：该研究将人工/电子舌感官评价与FBMN结合，从化学和感官两个层面解析了二次微生物发酵对六堡茶风味形成的贡献，明确了与甜味、苦味和陈香相关的关键代谢物，为黑茶品质提升和标准化发酵提供依据；新化合物结构及通路仍需NMR和功能实验进一步确认。
来源：公众号—茶科研